發布時間：2024-01-02 10:36:44
序言：寫作是分享個人見解和探索未知領域的橋梁，我們為您精選了8篇的細胞生物學研究樣本，期待這些樣本能夠為您提供豐富的參考和啟發，請盡情閱讀。
關鍵詞： 細胞生物學 考試方法 改革策略
細胞生物學作為生物學相關專業的基礎課程，其考核環節一直為我國高校相關專業所重視。傳統細胞生物學課程的考試環節主要以閉卷檢測作為考核方式，以考試分數作為標準對學生的學習能力及學習成績進行評定。這種考核方法難以有效地反映學生的綜合素質，因此對細胞生物學課程考試方法進行改革具有一定的必要性。
一、細胞生物學課程考試改革的原則與思路
（一）考試方法改革原則
由于細胞生物學課程專業性及理論性較強，對該課程考試的改革應以培養學生的自主創新能力及動手實踐能力作為切入點，根據學生的實際專業需求及個人能力的差異性對學生能力進行評價[1]。對專業成績的評述不應單純地以閉卷理論試卷成績為最終成績，應當綜合評價學生日常課堂表現、實驗課表現及課堂討論等環節表現出的能力，并對成績比例進行合理分配，具體考試方案由各專業教研部門自行確定。通過引入綜述論文、課堂發言、實驗課表現等環節的成績評定，可以有效提高學生的學習興趣。
（二）考試方法改革思路
對細胞生物學課程考試方法的改革，主要將考試成績合理地劃分為“閉卷理論考試（60%）+論文綜述（10%）+實驗課表現（20%）+日常課堂表現（10%）”四個部分。
1.對學生日常課堂表現進行評價
學生的學習活動以課堂學習為主，因此對學生日常課堂表現進行客觀評價可以有效地反映學生細胞生物學課程的知識水平及能力基礎。因此，將細胞生物學課程考試成績中的10%作為日常課堂表現的分值，主要對學生課堂參與程度、討論問題積極性、師生互動與溝通、課堂出勤率等方面進行考察，從而有效地提高細胞生物學課程教學質量。
2.對學生實驗課表現進行考核
細胞生物學課程主要由理論課及實踐課構成，實踐課教學可以有效地對理論進行驗證，是學生深化理論、接觸生物學領域的重要途徑。傳統細胞生物學課程的考試主要側重期末閉卷考試的考試成績，對實驗課考核重視程度不足，導致絕大多數生物教師在教學過程中缺乏相應的重視。將細胞生物學課程考試成績中的20%作為實驗課表現的分值，可以有效地提升學生實驗操作的積極性。
3.設計論文綜述環節進行考評
為了提升細胞生物學課程的考評的合理性，可以設計相應的論文綜述環節，對學生整體知識結構的掌握能力進行考核。論文綜述環節可以在考試周前一周至兩周進行，由教師提前布置相應的論文論述主題，給予學生充足的時間撰寫論文、制作幻燈片，在考核過程中由學生自主上臺進行論文匯報，再由其他學生進行自主提問。在評分過程中，可以將細胞生物學課程考試成績中的10%作為論文綜述環節的分值。
二、細胞生物學課程考試改革應注意的問題
（一）加強相關教師的素質培訓
隨著新課程改革的深化，雖然學生成為課堂教學活動的主體，但教師仍然處于主導者地位，教師的職業素質及教學觀念直接影響細胞生物學課程考試方法改革的貫徹效果。因此，為了保證細胞生物學課程考試改革的有效性，我國高校相關專業應當開展周期性培訓，培養生物教師相應的職業素養，相關專業教研室應根據教學活動的推進對教師進行跟蹤性的培訓，積極開展教學前期培訓、教學中期檢測及教學末期總結，保證生物教師可以明確細胞生物學考試方法改革的必要性，并從考試改革入手提高課堂教學質量。
（二）貫徹落實相應的考核操作
在明確了細胞生物學課程考試方法改革的原則與思路之后，應當將相應的方案與思路落實到實踐中，用實踐檢驗理想化的方案，提高細胞生物學課程考試方法改革的合理性[2]。在實際考核操作過程中，教師應當制定相應的規章制度明確相應的考核流程，并對學生課堂表現、課堂出勤情況等評價因素進行了解。在實際考核過程中，可以打破傳統單一性由教師評價學生的教學模式，引入相應的學生互評、學生自評評價機制，尊重學生實際能力的差異性，對學生成績進行合理的評估。
（三）在考核過程中加強教師的協作
由于細胞生物學課程考核具有較強的專業性及理論性，且考試改革涵蓋面與考察面較為廣泛，學生成績考核工作難以由一個教師單獨完成，因此應當以過程性目光看待細胞生物學課程考核工作，加強各環節教師的協作與溝通。在學生成績評價過程中，由不同的教師負責學生日常表現統計、學生論文綜述情況、學生試卷批閱等環節。在過程性評價中教師之間進行合理化分工，可以有效提升學生成績考核的合理性。
（四）引導學生注重日常學習過程
細胞生物學課程考核不僅具有檢測教學成果的功能，還具備評價功及引導功能[3]。傳統側重期末考試成績的考核模式對教學成果的評價較單一，很容易導致學生陷入學習時僅注重考點的學習誤區。對細胞生物學課程考試方法的改革對學生日常表現、實驗課表現等方面進行綜合考核，因此教師應當注重引導學生的日常學習課程，盡可能地消除功利性的學習目的。
總而言之，細胞生物學不僅是一門集理論性、創造性為一體的學科，而且是臨床醫學及生物學的學科基礎。在教學考核過程中，相關教師應當明確考試的評價功能及引導功能，樹立素質教育理念，利用多種形式的綜合性考核內容對學生學習情況進行考評。
參考文獻：
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[關鍵詞]RGD；人牙周膜細胞；黏附；增殖；堿性磷酸酶
[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）01-0054-03
The biological effects of arginlie-glycine-aspartic-Serine acid on periodontal ligament cell
BI Ying-chun，HE Yu-hong，XI Lan-lan
（Department of Stomatology，General Hospital of Jinan Military Area Command of Chinese，Jinan 250031，Shandong，China）
Abstract： Objective To observe the effects of arginlie-glycine-aspartic-Serine （RGDS） peptides on the biological behaviors of human periodontal ligament cells（PDL） so as to discuss the mechanism of RGDS and the feasibility of its applications in periodontal therapy. Methods The effects of RGDS on periodontal ligament cells adhesion，extension and as well as the effects on ALP were observed by cellular culture and solid bond phase analysis. Results RGDS could promote PDL adhesion and extension with significance at the concentration of 25～100mg/L（P
Key words：arginlie-glycine-aspartic；human periodontal ligament （PDL） cells； adhesion； proliferation； alkaline phosphatase
精氨酸 -甘氨酸-天門冬氨酸（Arg-Gly-Asp， RGD）三肽是多種細胞跨膜蛋白整合素的特異性配體，許多黏附蛋白所共有的細胞間及細胞-細胞外基質識別的最小序列，這一序列在介導細胞黏附、遷徙和生長方面起重要作用。牙周膜細胞在牙根面上的附著和增殖是牙周組織新附著的關鍵，本實驗目的是觀察離體細胞培養條件下，外源性RGDS對牙周膜細胞的影響，為進一步的臨床研究工作提供實驗依據。
1 材料和方法
1.1 材料：RGDS（Sigma）， 96孔培養板（Coster）， DMEM培養液和胰蛋白酶（Gibco），胎牛血清（FCS杭州四季青生物工程研究所）， 酶聯免疫檢測儀（DG3022A）， 牛血清白蛋白（BSA，博士德公司），噻唑鹽（MTT Sigma），ALP試劑盒，倒置顯微鏡（Olympus，Japan）。
1.2 人PDL的體外培養：取13～17歲因正畸需要拔除的新鮮前磨牙，隨即在無菌條件下用PBS緩沖液（含青、鏈霉素各1000U/ml）浸泡5～10min，并沖洗2次，除去血液，刮取牙根中1/3的牙周膜組織，剪成1mm3碎塊，均勻鋪于培養瓶底，瓶底向上，加入適量含100ml/L胎牛血清的DMEM培養液，在飽和濕度、50ml/LCO2、950ml/L空氣、37℃標準環境下孵育2h，翻轉，培養至長出牙周膜細胞。用2.5g/L胰蛋白酶消化法進行傳代，用免疫組化SABC法進行角蛋白和波形絲蛋白染色，波形絲蛋白染色陽性，角蛋白染色陰性，證明為中胚層組織來源。取第4代細胞用于實驗。
1.3 PDL細胞黏附性的測試--固相結合分析[1]：將RGDS溶于PBS液，分別制成100mg/L，50mg/L， 25mg/L，12.5mg/L4種濃度，每濃度為一實驗組。將各濃度組按每孔50μl包被96孔板，每種濃度4孔，陰性對照為10g/L BSA。將96孔板置于4℃，過夜。用PBS液洗96孔板各孔2次，加10g/L BSA，37℃封閉1h，PBS再洗2次。取第4代人PDL細胞，2.5g/L胰酶消化，離心，收集細胞，用不含血清的DMEM培養液吹懸細胞，形成5×108/L的細胞懸液，以每孔100μl接種于96孔板，37℃，50ml/LCO2條件下培養120min。取出培養板，PBS洗2次以去除未貼壁的細胞，2.5g/L胰酶消化，離心，將細胞懸浮于200μl無血清DMEM，血球計數板進行細胞計數，計算細胞總量。
1.4 PDL細胞伸展性的測試：實驗分組及96孔板的包被與實驗方法1.3相同，用無血清DMEM調整細胞濃度至107/L，每孔接種100μl， 標準環境下孵育120min，倒置顯微鏡下觀察各孔并照相。計數伸展細胞（即至少有一個胞漿突起的細胞）數和未伸展細胞數，每組至少計數100個細胞，計算伸展細胞的百分率。
1.5 RGDS對PDL細胞增殖的影響：實驗分組及96孔板的包被與實驗方法1.3相同，用無血清DMEM調整細胞濃度至107/L，每孔100μl接種于96孔板，10ml/LDMEM培養24h后，PBS 洗去未黏附細胞，重新加入10ml/L胎牛血清DMEM100μl，將96孔板置37℃、50ml/LCO2條件下繼續培養5天后，MTT法測不同濃度RDGS對PDL細胞的影響。
1.6 RGDS對PDL細胞堿性磷酸酶（ALP）的影響：將PDL細胞按1.5的方法培養5天后， PBS洗3次，每孔加1ml/L TritonX-100 50μl，4℃過夜。次日每孔加堿性磷酸酶抗體100μl，37℃、50ml/LCO2孵育30min，加0.2mol/LNaOH 50μl終止反應。酶聯免疫檢測儀410nm檢測A值。
1.7 數據分析：運用統計學軟件SPSS10.0進行組間t檢驗， P
2 結果
2.1 RGDS對PDL細胞黏附性和伸展性的影響：如表1所示，隨著RGDS濃度增加，其促進PDL細胞的黏附率的作用逐漸增強，當濃度為12.5mg/L時，與對照組相比較，既有促進細胞黏附作用（P
細胞伸展性實驗也說明，在RGDS濃度為12.5mg/L時，即有促進細胞伸展功能（P
2.2 RGDS對PDL細胞增殖和ALP的影響：RGDS在50～100mg/L可明顯促進細胞增殖，濃度在25～100mg/L明顯提高HPDL細胞的ALP的活性。見表2。
3 討論
本實驗運用固相結合分析技術，將RGDS固定于96孔板上，為排除血清中某些因素對實驗結果的影響，在黏附和伸展實驗中采用無血清的DMEM，在增殖和ALP活性檢測時，因培養時間較長（5天），采用細胞能耐受的1%胎牛血清濃度。實驗結果顯示：在濃度為25mg/L可顯著促進PDL細胞的黏附、伸展，而較高濃度的促進作用卻不明顯，可能在此濃度時細胞膜上受置已飽和，再增加RGDS并不能使黏附率明顯上升。而細胞伸展性也顯示，當RGDS濃度達到25mg/L時，細胞在2h的伸展率達到了50%以上，倒置顯微鏡下可見經RGDS處理過的細胞胞體呈梭行或多角性，既細胞有一個以上的突起，呈現良好的伸展狀態。而未經RGDS處理的對照組細胞形態呈圓形，無突起或僅有少量突起，細胞伸展狀態不佳。
精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸（RGD）是細胞外基質中許多黏附蛋白所共同含有的一個三肽序列，它是黏附蛋白與細胞表面特異受體蛋白相互作用的識別位點。這些細胞表面膜蛋白被稱為整合素（integrin）。整合素家族的分子都是由α、β兩條鏈由非共價鍵連接組成的異源雙體，為一跨膜結構，一端連接細胞內的骨架系統，另一端通過RGD識別位點與細胞外基質連接，形成配體-整合素-細胞骨架跨膜信息系統，從而將細胞外基質和細胞骨架連接起來，引起細胞內一系列生化改變：如：酪氨酸磷酸化、胞漿堿化、鈣離子濃度提高、大量磷脂代謝產物產生等，進而影響多種組織細胞功能調控，包括胚胎發育、細胞的伸展、移動、生長、分化、血栓形成、創傷修復、腫瘤轉移等一系列重要生理病理過程[2-3]。1984年，Pierschbacher和Ruolslahti[4]首次用實驗證實RGDS是纖維連接蛋白與其受體的特異性結合位點，可促進鼠腎成纖維細胞在生物材料表面的黏附，從此對于RGD配體與受體相互作用機制的研究引起了人們的廣泛關注。許多學者[5]研究了RGD與生物材料的不同結合對細胞在粘附、增殖、遷徙等方面的影響，顯示RGD與材料表面的穩定的連接是促進細胞粘附、增殖的關鍵。
ALP是參與骨等硬組織形成﹑代謝﹑再生的重要調節物質，它通過水解磷酸脂﹑ATP及焦磷酸鹽，能去除鈣化抑制物，提供能量，促進鈣化[6]。同時ALP也是細胞分化活躍和具有成骨能力的標志之一[7]。而牙周膜細胞具骨母樣細胞特性，ALP也是牙周膜細胞分化和向成骨樣細胞轉化的先決條件。本實驗中，RGDS在濃度25mg/L即可提高牙周膜細胞ALP水平，這可能是RGDS通過激活整合素受體蛋白，引起胞內細胞骨架改變，從而促進細胞貼壁、伸展，進而促進細胞增殖，使其分化提前，因此ALP水平的提高極可能是由于牙周膜細胞數量增加引起，但無論什么原因，RGDS這種促增殖與分化的作用在牙周組織修復過程中具有重要意義。
牙周組織再生的一個中心環節是牙槽骨和牙骨質的重建及功能性牙周膜的完全再生，即形成牙周新附著，而PDL細胞作為具有異質性的多能干細胞，其在根面上的黏附、生長、分化是形成新附著的關鍵。本實驗結果證實RGDS可有效促進PDL的黏附、伸展、增殖和分化。已有學者將含有RGD的七肽固定于I型膠原材料，PDL粘附率明顯提高[8]。因而如果將RGD應用于引導牙周組織再生的過程中，則有可能促進PDL細胞在根面上黏附、伸展，激活PDL細胞成骨功能，促進牙周組織再生，這對體內應用RGDS促進牙周新附著的形成有一定的指導意義。
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摘要從教學內容、教學過程和考核方式等方面介紹了研究生細胞分子生物學課程的教學開展與體會，為適應多研究方向的研究生培養要求、提高教學效果提供參考。
關鍵詞研究生;細胞分子生物學;教學;內容;考核
揚州大學碩士研究生培養方案課程設置將細胞分子生物學作為生物學一級學科的學位課程，包含植物學、動物學、生理學、水生生物學、微生物學、遺傳學、發育生物學、細胞生物學、生物化學與分子生物學、生物物理學、生態學等11個生物學二級學科。揚州大學是江蘇省屬重點綜合性大學，目前設有27個學院，11個生物學二級學科分散在生物科學與技術學院、農學院、獸醫學院、醫學院，各二級學科的研究方向也較廣泛，如何適應這種多學院、多學科和多研究方向的碩士研究生培養要求，提高教學效果，揚州大學不斷進行嘗試、改革，構建了適合各二級學科培養目標要求的細胞分子生物學教學體系，現將這門課程的教學內容、教學過程和考核方式介紹如下。
1細胞分子生物學的教學內容
細胞分子生物學是隨著細胞生物學和分子生物學發展而興起的一門較新的學科，是一門在分子水平上研究基因對細胞活動調控以及各種細胞結構的形成和功能執行的科學[1]。對生物學專業的研究生來講，本科階段都學過細胞生物學和分子生物學這2門課程，因此研究生所開設的細胞分子生物學課程體系應該和本科生的課程體系有所區別。由于傳統的細胞分子生物學教材與細胞生物學和分子生物學在內容上有很多雷同，若采用這些教材，很容易使研究生對該門課程失去興趣。揚州大學將該門課程的教學內容分為4個部分:細胞結構、細胞遺傳、細胞代謝與調控、細胞發育，該校沒有選擇任何固定教材，僅僅指定少數最新出版的教材作為參考書，如韓貽仁主編的分子細胞生物學[2]、Gerald Karp主編的Cell and Molecular Biology:Concepts and Experi-ments等[3]。
2細胞分子生物學的教學過程
揚州大學細胞分子生物學的授課對象差異比較大，學生的來源和專業背景也不同，在教學過程中，筆者嘗試使用開放式教師、開放式教學和開放式課堂的教學方法。
2.1開放式教師
以往的研究生課程都是由固定的教師一上到底，由于教師的精力有限，不可能對細胞生物學各個領域的前沿知識都熟悉。為了解決這一問題，揚州大學采用不固定教師上課的制度，跨學科跨學院請資深教師進行授課，確保學生能夠了解該領域的基本知識與前沿動態。設置的4個部分教學內容中，每一部分由1~2位專業教師負責主講，教師可結合自己的專業背景，根據不同教學模塊，設置具體的教學內容，不拘泥于任何教科書進行授課。有些教師的研究方向是植物，對植物細胞分子生物學的研究進展和前沿動態比較熟悉，講授植物細胞分子生物學可以做到深入淺出，而對動物細胞分子生物學的講授效果會比較差，因此主講教師可選擇來自植物、動物、微生物、病毒等研究方向的老師。對于學生，有些是來源于農學院，其背景知識和興趣側重在植物方面，而有些來源于醫學院或獸醫學院，其背景知識和興趣側重在動物方面，這就要求選擇具有不同學科背景的教師。開展開放式的教學方式，滿足不同學生的要求。
2.2開放式教學
由于細胞生物學是生命科學的前沿學科之一，因此在把握現有教材和參考資料的基礎上，教學過程中要結合實際將細胞生物學相關領域的新進展、新知識、新方法介紹給學生，拓寬學生知識的深度、廣度，培養其對未來工作的適應能力。
在每一個教學模塊中，教師可通過不同的教學方式講解不同側重點的專題。如細胞結構部分包括講了2個專題，一個是細胞內膜系統:結構、功能、蛋白質分選和膜泡運輸，另一個是細胞骨架與細胞運動。內膜系統一般是指內質網、高爾基體、細胞核、溶酶體和液泡(包括內體和分泌泡)5類細胞器膜的總稱，而廣義的內膜系統概念也包括線粒體、葉綠體、過氧化物酶體、細胞核等細胞內所有細胞器膜的總稱。在本科細胞生物學教學過程中，這些細胞器的形態結構、功能和發生是分別獨立介紹。雖然這些細胞器具有各自獨立的結構和功能[4]，但它們又是密切相關的，尤其是它們的膜結構是可以相互轉換的，轉換的機制則是通過蛋白質分選和膜泡運輸來實現的。在講授內膜系統時，可通過蛋白質合成這條線將這些相關內容串聯起來講述。由于核糖體在蛋白質合成上與內膜系統互為一體，因此將核糖體也加入進來，同時向上講可以提及細胞核中核糖體大小亞基及mRNA的合成，向下還可講述細胞膜上的蛋白功能，從而用蛋白質合成一條線將細胞的三大結構即細胞膜、細胞質和細胞核聯系了起來。同時，也啟迪研究生自己去找線索，找出一根主干，將盡可能多的內容串起來。又如細胞骨架對于維持細胞的形態結構及內部結構的有序性以及在細胞運動、物質運輸、能量轉換、信息傳遞和細胞分化分裂等一系列方面起重要作用，因此對細胞骨架的研究是近代生命科學中最活躍的研究領域之一，它的快速發展主要得益于大型分析儀器的應用和實驗方法技術的改進。在這一部分內容的教學中，可重點向學生講解細胞骨架的研究方法，包括每種方法的原理、基本過程和結果分析，以最新的國外權威期刊上發表的細胞骨架方面的論文為例，向學生介紹細胞骨架的研究是如何開展的。
2.3開放式課堂
研究生課堂和本科生課堂相比，講授內容量非常大。筆者一般會在課后將課件提供給學生，使他們在課堂上不用花太多精力記筆記，而是將主要精力集中到聽課上，跟著教師的引導考慮問題，這樣使其思維保持很高的興奮度，且感到疲勞。在嚴格遵守課堂紀律的前提下，在上課時要盡量調動學生的積極性，以開拓學生的思維，培養創造性。課后要讓學生自己閱讀指定或推薦的原始文獻，或者讓他們自己到網上查閱自己感興趣的問題，以此可培養學生閱讀文獻、查找資料、進行科研的能力。
3細胞分子生物學的考核方式
作為生物學一級學科碩士研究生的學位課程，細胞分子生物學的考核以考試為主，考慮到研究生學習細胞分子生物學課的目的主要是為了提高學生利用學到的細胞生物學知識解決課題研究中的問題，實用性較強，因此筆者選用開卷考試的形式，所出的試題都是綜合性的分析題，在考場內學生可以查閱任何參考資料，但參考資料中沒有現成的答案，促使學生綜合運用所學知識，通過仔細分析才能得出答案。這種考核方式一方面提高了學生獨立思考問題和解決問題的能力，另一方面也使教師了解了學生對這門課程的掌握情況，檢驗教學質量，很大程度上促進了以后教學的開展。
4參考文獻
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與臨床病理學相比，腫瘤分子生物學標記為腫瘤生物學行為的分析、治療方式的選擇、臨床預后的判斷提供了更客觀、更豐富的信息，全文就目前國內外對膀胱移行細胞癌分子生物學標記物的研究概況作一綜述。
【關鍵詞】 膀胱移行細胞癌 標志物 分子生物學 免疫學
膀胱移行細胞癌（TCC）的主要特征有多中心性和易復發性，腫瘤細胞易于種植轉移，臨床上僅根據腫瘤病理判斷預后較為困難。鑒于此，目前對其分子生物學標記物的研究愈來愈多，如p53、p21、Ki67、bcl?鄄2等。已有多篇文獻報道分析了相關分子生物學標記物與泌尿系統上皮腫瘤的病理分級、臨床分期、復發及生存率的關系，為診斷腫瘤、制定正確的治療方案及判斷預后等提供重要的信息，本文就目前已報道的分子生物學標記物作一綜述。
1 癌基因與抑癌基因
1.1 p53
p53的突變或丟失在膀胱癌的檢出率為50％～60％，Migaldi等[1]分析不同年齡膀胱癌患者的p53表達，發現p53異常表達在小于45歲的膀胱癌患者更為常見。大量研究表明，p53的改變與膀胱癌的分期、分級、侵襲性有關，但其是否與膀胱癌的復發及生存率相關仍有爭議。Yeniyol等[2]采用免疫組化檢測48例膀胱移行細胞癌標本中p53的表達，p53異常表達在不同臨床分期和病理分級間差異顯著，但未發現p53陽性組與陰性組腫瘤復發率和死亡率有明顯差異。Stavropoulos（n＝58）和Ong（n＝64）等[3]也得出類似的結論。但另有多篇文獻報道，p53與膀胱癌的復發率和死亡率顯著相關。Sanchez等[4]報道復發的膀胱癌（n＝47）p53的異常表達明顯高于未復發者，p53的異常表達與膀胱癌的進展和生存率相關。Wolf等報道p53異常表達與pT1G3膀胱癌（n＝30）的預后關系密切。
p53突變可能與膀胱原位癌（CIS）的生物學行為有關，導致CIS的侵襲性增加，Shariat等[5]檢測47例膀胱CIS的p53及其中39例標本的p21表達，p53/p21聯合分析顯示出與腫瘤的復發、進展及生存率之間密切的相關性，p53（+）/p21（+）患者腫瘤復發進展和死亡的危險程度遠大于p53（+）/p21（-）或p53（－）/p21（－）者。
1.2 p21
關于p21與膀胱癌的報道結果并不統一，Chatterjee等[6]檢測p53、p21、pRb在164例TCC標本中的表達，結果顯示p53、p21、pRb可作為判斷TCC復發率和5年生存率的獨立因子，三者聯合分析顯示出與TCC預后之間良好的相關性。Kuczyk MA等也認為p21WAF/CIP1可以作為判斷膀胱癌生存率的獨立預后因子。Liukkonen等[7]檢測207例膀胱癌(pTa～pT1)標本中p21WAF1/CIP1和細胞周期素D1的表達，平均隨訪4.9年，分析其與腫瘤分期、分級、細胞增殖率（MIB?鄄1指數）、p53、bcl?鄄2、生存率的關系。結果只有MIB?鄄1指數與無瘤生存率顯著相關（P=0.03），腫瘤復發率只與腫瘤分級（P=0.002）和細胞周期素D1的表達相關（P=0.04），提示p21WAF1/CIP1與其他因子相比預后作用較小，有關p21WAF1/CIP1在判斷膀胱癌預后中的意義有待進一步闡明。
1.3 p16 /CDKN2A
Hitchings等[8]檢測78例TCC 標本（pTa～pT1） p53、p16、pRb的表達，多因素分析顯示任何兩者的改變與腫瘤的進展密切相關，p53和 p16同時表達異常者腫瘤的進展可能性增加14.45 倍，提示p53和 p16可用來判斷pTa～pT1期膀胱腫瘤的進展情況。Benedict等發現腫瘤標本中p16/CDKN2A的表達與Rb的表達呈負相關，Rb強染色的標本罕見p16陽性染色，同時，伴染色體9p21的雜合丟失的腫瘤p16/CDKN2A失表達，Rb強表達。Primdahl等發現初診即為浸潤型膀胱癌p16/CDKN2A的表達顯著低于繼發于Ta 或T1的浸潤期腫瘤，有關進一步解釋尚待研究。
1.4 Rb
Sanchez Zalabardo D等[4]隨訪47例浸潤型膀胱癌患者，發現Rb表達異常的患者腫瘤進展速度、復發率顯著升高。Sunanda等檢測164例TCC標本pRb的表達，得出結論pRb可作為判斷TCC復發和生存率的獨立預后因子。另有報道對45例T1期膀胱腫瘤患者隨訪發現Rb基因的丟失與pRb的異常表達明顯導致患者無瘤生存率降低，此外，多篇文獻報道Rb在與p21、p16、Ki67、p53等聯合判斷膀胱癌預后時表現出良好的相關性，可作為較理想預后因子。
2 細胞增殖相關指標
細胞核相關抗原（Ki67）是增殖性細胞核的標記物，可通過單克隆抗體MIB?鄄1檢測，其在判斷膀胱癌預后中的重要意義被越來越多的作者證實。Migaldi等發現老年患者膀胱癌標本MIB?鄄1指數高于年輕者，并且與膀胱癌復發率、生存率密切相關[9]。Nakopoulou等(n=94)、Saika等（n=203）、Santos等（n＝159）也研究發現Ki67是膀胱癌良好的獨立預后因子。
Frank等[10]選取伴區域淋巴結轉移的尿道膀胱腫瘤139例，手術切除腫瘤并行化療，隨訪分析p53和MIB?鄄1在判斷腫瘤預后及化療療效中的作用，結果并未發現p53和MIB?鄄1與該類腫瘤患者的預后具有顯著性相關，但MIB?鄄1指數與腫瘤的化療療效呈顯著負相關，提示MIB?鄄1可以作為判斷膀胱癌化療療效的指標，指導臨床治療。同樣，Matsumoto等對62例膀胱移行細胞癌（pT1G3～pT4M0）標本進行類似研究，平均隨訪34個月，發現Ki67的表達與腫瘤化療完全緩解率顯著性相關，能較好地判斷療效。
3 細胞凋亡相關指標
3.1 bcl?鄄2/bax
bcl?鄄2被認為是抑制細胞凋亡的重要的原癌基因。bcl?鄄2、bax屬于凋亡調控基因bcl?鄄2 基因家族， 分別能夠阻遏和促進凋亡， bax?鄄bax同源二聚體促進凋亡，bcl?鄄2?鄄bax異聚體阻遏凋亡，突變的p53蛋白可起到與bcl?鄄2蛋白類似的作用，并抑制bax基因的轉錄，進而抑制凋亡。
Uchida T等觀察到119例膀胱癌患者中p53的表達與腫瘤分期分級相關，bcl?鄄2表達與腫瘤臨床病理特征無關，但p53和bcl?鄄2同時過表達提示不良預后[11]。Wolf、Gazzaniga等也證實bcl?鄄2的表達與腫瘤復發率和無瘤生存率明顯相關。但 Asci R等[12]報道年齡小于40歲患者TCC細胞漿bcl?鄄2和p53的表達分別為54%、37%，與腫瘤的進展無明顯相關。同樣，Fraile、Stavropoulos等報道bcl?鄄2的表達與膀胱癌的分期、分級及復發率無明顯相關，提示有關bcl?鄄2的作用仍需進一步研究。
3.2 Fas/FasL
Fas與FasL都是跨膜蛋白，分別屬于TNF受體和TNF家族，T淋巴細胞和NK細胞的活化可導致細胞表面FasL被激活，與Fas結合，使表達Fas的細胞發生凋亡。Lee SH等檢測37例膀胱癌標本，Fas/FasL的高表達達到92％。Lee等報道43例膀胱腫瘤標本28％有Fas基因的突變。目前對血液中可溶性Fas (sFas)和可溶性FasL (sFasL)研究較多，Mizutani等[13]報道sFas或sFasL的升高預示Ta期膀胱癌患者早期復發的可能，sFas或sFasL可作為判斷Ta期膀胱癌復況的預后因子。
4 血管形成因子
4.1 VEGF
與大多數實體瘤一樣，膀胱癌的形成也具有血管形成依賴性，與血管內皮生長因子VEGF關系密切。Vasilios等[14]研究VEGF和低氧誘導因子(HIF?鄄1α)之間的關系及兩者在TCC中的預后意義，結果顯示HIF?鄄1α與腫瘤病理分級顯著相關，VEGF和微血管密度（MVD）與腫瘤分級和臨床分期顯著相關。HIF?鄄1α與VEGF和MVD顯著相關，提示VEGF和HIF?鄄1α的升高刺激血管生成，導致腫瘤預后不良。同樣，Santos（n＝66）也報道VEGF可作為判斷膀胱上皮腫瘤的預后因子。
4.2 血栓黏合素?鄄1
血栓黏合素?鄄1(TSP?鄄1) 是細胞外基質中的一種糖蛋白，分子量為430kD。TSP?鄄1被認為是惟一抑制腫瘤血管形成的物質。Grossfeld等[15]分析了163例TCC標本TSP?鄄1、p53的表達與TCC復發生存率之間的關系，TSP?鄄1表達與TCC復發 （P=0.009）和生存率（P=0.023) 顯著相關，低表達TSP?鄄1患者腫瘤復發率增高，生存率降低。
5 生長因子及受體
5.1 EGFR
EGFR在眾多上皮腫瘤中有較高的陽性表達，Colquhoun等[16]綜述了近年來有關EGFR與膀胱癌的研究，得出結論EGFR的表達與膀胱癌的分期、分級、復發率、無瘤生存率明顯相關，EGFR過表達提示腫瘤預后不佳，使用抑制EGFR活性的物質如ZD 1839等可望成為臨床治療膀胱癌等的新手段。
5.2 TGFα
TGFα在膀胱癌中的表達顯著高于正常膀胱組織，Ravery等報道43例膀胱癌中60％存在TGFα高表達，且與腫瘤死亡率顯著相關。Ravery等分析28例早期膀胱腫瘤TGFα?鄄mRNA的表達，隨訪兩年發現其與腫瘤復發顯著相關，對判斷早期膀胱腫瘤的預后有重要價值。Thogersen等則報道TGFα與EGFR的表達相關，但與患者生存率無明顯相關，其在判斷膀胱癌預后中的作用有待研究。
6 細胞外基質與細胞黏附分子
6.1 MMPs
Hara等[17]分析51例表淺TCC中MMP?鄄2、MMP?鄄9、膜型MMP?鄄1 (MT1?鄄MMP)與腫瘤復發率間的關系，復發組MMP?鄄9的表達是未復發組的2.5倍，未發現MMP?鄄2、MT1?鄄MMP表達的差異，MMP?鄄9高表達組無瘤生存率顯著低于正常表達組。同樣，Ozdemir等檢測60例膀胱癌MMP?鄄1，MMP?鄄2，MMP?鄄9的表達，發現只有MMP?鄄9的表達與腫瘤的分期分級相關。Papathoma等報道隨著尿路上皮腫瘤分級和浸潤程度的升高，MMP?鄄9和MMP?鄄2表達顯著升高，但兩者與腫瘤的復發率無明顯相關，提示其在判斷膀胱癌轉移和預后中的意義仍有待研究。
6.2 E?鄄鈣黏蛋白
E?鄄鈣黏蛋白的表達與腫瘤分化、癌細胞侵襲能力及轉移可能相關。Shahrokh等檢測53例膀胱CIS標本E?鄄鈣黏蛋白的表達，隨訪131個月，多因素分析表明E?鄄鈣黏蛋白是與CIS復發、進展、無瘤生存率顯著相關的獨立因素，提示E?鄄鈣黏蛋白異常表達的腫瘤侵襲性高，需要早期徹底治療。Rao等分析細胞支架蛋白－肌動蛋白（Gelsolin）和E?鄄鈣黏蛋白在判斷膀胱癌預后中的意義，結果示Gelsolin與膀胱癌進展和復發密切相關，但未發現E?鄄鈣黏蛋白在判斷膀胱癌預后中的顯著意義，其在判斷膀胱癌預后中的意義還有待明確。
與臨床病理學相比，腫瘤分子生物學標記為腫瘤生物學行為的分析、治療方式的選擇、臨床預后的判斷提供了更客觀、更豐富的信息，深入研究此類標記十分必要。目前對泌尿系統上皮腫瘤分子生物學標記物的研究雖已取得進展，但除了對個別標記物Rb、Ki67的意見較為統一外，對絕大多數標記物在腫瘤中的表達分布及預后價值仍存在爭議，目前的文獻報道多存在樣本量小的問題，缺少大規模研究的支持，再加上免疫組化法檢測蛋白受抗體選擇、陽性結果判斷、手工操作等外在因素影響的問題，導致研究結果之間缺乏可比性或對同類研究對象得出相反的結論，因此需要將實驗方法標準化以提高研究的可靠性和可重復性。此外，由于腫瘤的進展和轉移是涉及多種分子機制的極其復雜的過程，僅憑對單一預后指標的評估不能全面準確地反映腫瘤的惡性潛能，腫瘤免疫標記物最終的臨床應用可能是多個指標的綜合評估。
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目的初步探討何首烏提取物聚酰胺柱層析流分對人臍靜脈血管內皮細胞增殖的影響。方法MTT比色法檢測何首烏提取物聚酰胺柱層析流分對人臍靜脈血管內皮細胞生長的促進作用；HE染色法觀察其流分對人臍靜脈血管內皮細胞形態學的影響。結果經聚酰胺柱層析洗脫的何首烏流分對人臍靜脈血管內皮細胞增殖具有不同的作用，其中D流分隨著濃度的增加，對人臍靜脈血管內皮細胞增殖具有促進作用，顯微鏡下觀察到細胞的數量及分裂相增多，B和C流分對細胞的增殖影響不大，而A流分對血管內皮細胞具有抑制生長作用，細胞的數量減少，核固縮。結論何首烏提取物聚酰胺柱層析流分中含有促人臍靜脈血管內皮細胞生長的活性物質。
【關鍵詞】 何首烏 聚酰胺柱色譜 人臍靜脈血管內皮細胞 MTT比色法 HE染色法
Abstract:ObjectiveTo investigate the proliferation effects on human umbilical vein vascular endothelial cells(HUVECs)of the fractions isolated from Polygonum multiflorm Thunb extracted with polyamide column chromatography. MethodsThe activity of promoting HUVECs growth of each fraction was observed by MTT colorimetric assay. The changes of HUVECs morphology were observed by HE stain. ResultsThe fractions eluted from polyamide column chromatography had different proliferation activities on HUVECs. With the increase of concentration，the fraction D could promote the growth and proliferation of HUVECs significantly. The cells showed morphological change significantly under microscope. Compared with the control，the cell quantity and mitosis of the fraction D were increased. However， there was little or no effects on the proliferation of HUVECs by fraction B and C. In contrast， fraction A had an inhibitory effect on the growth of HUVECs ， which caused the decrease in the cell number and karyopycnosis. ConclusionThere are some components of promotion growth of HUVECs in the fraction from polygonum multiflorm Thunb.
Key words: Polygonum multiflorm Thunb.； Polyamide column chromatography； Human umbilical vein vascular endothelial cell(HUVEC)； MTT colorimetric assay； HE stain
何首烏Polygonum multiflorm Thunb.系蓼科植物何首烏的干燥塊根，具有烏須發、悅顏色、補肝腎、抗衰老之良效［1］。現代藥理學研究表明其醇提或水提液具有提高免疫力、抑制血小板聚集、舒張血管、抗氧化等作用，且這些作用與其中的活性成分二苯乙烯苷（2，3，5，4＇-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glucoside）有關［1，2］。二苯乙烯苷又稱芪多酚，屬多羥基芪類化合物，現代藥理學研究表明，其具有清除自由基［2］、降低膽固醇［3］、保護肝臟等［4］作用。本實驗采用MTT法和HE染色法觀察何首烏提取物聚酰胺柱層析流分對人臍靜脈血管內皮細胞增殖的影響，為何首烏的進一步開發和利用提供依據。
1 材料與儀器
1.1 材料
聚酰胺（60～80目）和聚酰胺薄膜（10 cm×10 cm）購于浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠；何首烏飲片購自廣西醫藥公司；人臍靜脈血管內皮細胞購自武漢大學保藏中心。
1.2 儀器
RE-52型旋轉蒸發儀(上海博通)；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；紫外線檢出器(日本)；二氧化碳培養箱(Thermo Forma MODEL 3111)；Σ960酶標儀；倒置相差熒光顯微鏡（Olympus CXZIFSZ）；生物顯微鏡（日本Olympus）。
1.3 試劑乙醇；丙酮；甲醇(成都市科龍化工)；冰乙酸(上海實意化學試劑有限公司)；無水乙醇(重慶川江化工)；氯仿(廣東省化學試劑工程技術研究開發中心)，以上試劑級別均為分析純。RPMI1640培養基（GIBCO Invitrogen cooperation）；新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)。
自配試劑 ：2%三氯化鐵-2%鐵氰化鉀顯色劑；0.5%胰蛋白酶溶液；PBS；蘇木精染液；伊紅染液及1%稀鹽酸乙醇溶液。
2 方法
2.1 何首烏流分提取分離取2 kg何首烏粉用4倍量70%乙醇回流提取，濃縮后的總浸膏依次采用環己烷、醋酸乙酯、正丁醇分別進行萃取。采用聚酰胺柱層析法，以蒸餾水-乙醇為洗脫劑對正丁醇層浸膏進行分離，收集各流分；點樣，在365 nm處用紫外燈觀察，并以2%三氯化鐵-2%鐵氰化鉀顯色跟蹤檢測，合并相同流分，減壓濃縮。按洗脫順序分別得到A，B，C，D流分組。
2.2 活性研究
2.2.1 細胞的培養人臍靜脈血管內皮細胞培養于含體積分數為10%熱滅活新生牛血清的培養液中，置二氧化碳培養箱，在37℃，5％CO2條件下培養。
2.2.2 MTT法測定細胞生長增殖實驗取指數生長期細胞用0.5%胰蛋白酶消化，加入含小牛血清的培養液計數并稀釋至1×104個/ml。將稀釋的細胞懸液按100 μl/孔接種至96孔板，置37℃，5%CO2培養箱中孵育24 h至細胞貼壁后，選擇A，B，C，D 4種流分，每組設5個濃度梯度加入至96孔板中，每個濃度設3個平行孔。同時設PBS空白對照組6孔，繼續培養72 h，取出孔板，每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT，37℃、5%CO2條件下孵育4 h，棄盡孔內液，每孔中加入200 μl的DMSO溶解MTT產物。振蕩30 s，用酶標儀于490 nm處測定每個孔的吸光值A值。計算存活率：細胞存活率(%)=(用藥組平均A值/對照組平均A值)×100%
2.2.3 HE染色法觀察流分對人臍靜脈血管內皮細胞形態的影響取貼壁生長的細胞，用0.5%胰蛋白酶消化，加入含小牛血清的培養液計數并稀釋至1×104個/ml。 將稀釋的細胞懸液按2 ml/孔接種至6孔板，加入已高壓滅菌的蓋玻片，培養24 h后，加入不同濃度的流分，藥物組設定如下：A流分組、D流分組，每組設兩個濃度梯度，每個濃度設2個平行孔；同時設2孔空白對照組。培養24 h后，取出蓋玻片。用95％乙醇固定，蘇木精及伊紅染色，乙醇脫水，二甲苯透明，最后用中性樹膠封片，攝像。
3 結果
3.1 MTT實驗結果不同濃度的流分分別作用于人臍靜脈血管內皮細胞后，采用MTT法測定其對細胞生長的作用。其中流分D對人臍靜脈血管內皮細胞的生長具有促進作用，出現明顯的量效關系，即濃度越高，存活率越高。流分A對人臍靜脈血管內皮細胞具有一定的抑制生長作用。流分B，C與對照組比較，基本無差異。結果見表1。
表1 何首烏提取物4種流分對人臍靜脈血管內皮細胞生長的作用(略)
3.2 細胞形態學改變經HE染色后顯微鏡觀察，可見正常的人臍靜脈血管內皮細胞呈梭形，細胞漿豐富，均勻，細胞核規則，呈紫藍色，核內染色均一。A流分組對細胞具有抑制作用，光鏡下觀察到細胞的數量減少，部分細胞特別是高濃度組出現胞漿減少，核固縮現象。D流分組對細胞具有明顯的促進生長作用，尤其是高濃度組表現為細胞生長旺盛，核分裂相增多，細胞數量增多。見圖1。
4 討論
聚酰胺是通過己內酰胺聚合而成的尼龍-6（錦綸、卡普隆）及由己二酸與己二胺聚合而成的尼龍-66，是一種白色多孔非晶型粉末，其分子中含有豐富的酰胺基，可與多酚類化合物的羥基（或羧基）形成分子間氫鍵而將其吸附。分子中酚羥基數目越多，芳香化程度越高的化合物與酰胺基的結合力越強，從而實現與其它物質的分離［5］。結合本文MTT法結果可以知道，較晚洗脫出來的流分D，對人臍靜脈血管內皮細胞具有促進增殖生長作用，推測流分D中促進血管內皮細胞生長的物質可能與含有酚羥基數目較多有關。但要確定酚羥基是否為促人臍靜脈血管內皮細胞生長的藥效團有待進一步研究。
血管內皮細胞在維持血管張力和血流調節方面發揮重要作用，內皮細胞還可以阻止血小板和白細胞的激活，所以完整的內皮系統在維持血管穩定和防止血栓方面發揮重要作用。臨床實踐證實中藥何首烏提取物對生物體多種代謝活性具有積極的影響作用。本實驗結果表明，在何首烏醇提物的正丁醇萃取物中含有對血管內皮細胞增殖產生促進作用的活性物質，可使細胞的分裂相增多，染色質豐富，為進一步從何首烏中分離純化具有保護和修復血管內皮細胞的活性物質提供了依據。
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【摘要】 為了了解凍存復蘇過程對骨髓間充質干細胞 (mesenchymal stem cell，MSC) 生物學特性和支持造血能力的影響，采用常規方法分離培養骨髓MSC，將傳代后的細胞用含10％二甲亞砜、40％胎牛血清的IMDM細胞凍存液保存在-196℃液氮中，觀察短期（4周）和中期（9-15月）復蘇后MSC的活性、免疫表型、多向分化能力和支持造血的能力，并同凍存前的MSC進行比較。 結果表明：中短期凍存后的MSC的細胞活性分別為(90士3.75)％和(93士2.51)％；凍存后細胞的增殖能力、免疫表型、體外分化為脂肪和骨細胞的能力、支持集落（CFU-GM，CFU-E，CFU-GEMM）的生長作用和凍存前MSC相似。結論：骨髓MSC在液氮中短期和中期保存后，細胞活性略有下降，但是并不影響MSC的增殖、分化和支持造血能力。
【關鍵詞】 支持造血
Biological Characteristics and Ability of Supporting Hematopoiesis of Bone Marrow Mesenchymal
Stem Cells Pre-and Post-Cryop-reservation
Abstract This study was aimed to observe the biological characteristics of cryopreserved bone marrow mesenchymal stem cell (MSC) and to examine their abilities to support in vitro hematopoiesis.Bone marrow MSC were cryopreserved in -196℃ liquid nitrogen for 4 weeks (short term) and 9-15 months (medium term) with IMDM containing 10% DMSO，40% fetal calf serum as cryoprotectant.The viability，proliferation，immunophenotype，in vitro differentiation and ability of supporting hematopoiesis of thawed MSC were investigated and compared with these of pre-cryopreserved MSC.The results showed that the cell viability were (93士2.51)％ and (90士3.75)％ for MSC cryopreserved as long as 4 weeks or 9-15 months respectively.However，there were no changes detected，as compared with pre-cryopreserved MSC in immunophenotype，abilities of proliferation and supporting colony forming of CFU-GM，CFU-E and CFU-GEMM.It is concluded that bone marrow-derived MSC can be stored in liquid nitrogen for short-term (4 weeks) or medium-term (9-15 months) without changes of abilities of proliferation，differentiation and hematopoiesis support.
Key words cryopreservation; mesenchymal stem cell； hematopoiesis support
間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）具有多向分化和支持造血的能力，而且來源廣泛，容易在體外培養和擴增，目前已經應用于臨床并顯示了良好的治療效果［1-4］。將培養后的MSC凍存，在患者需要MSC治療時給予輸注，具有很好的臨床應用前景。但是，凍存是否會影響MSC的生物學特征，我們尚不清楚。因此，本研究將骨髓來源的MSC凍存于-196℃液氮中，觀察中期和短期凍存后MSC的增殖、分化和支持造血的能力并同凍存前的MSC進行比較，為進一步在臨床中的應用提供詳盡的實驗依據。
材料和方法
試劑
IMDM、DMEM、DF12、MCDB培養液、胎牛血清、馬血清和甲基纖維素均為Gibco公司產品。鼠抗人CD11b、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD105和HLA-DR抗體購自PharMingen公司; rh-SCF、 GM-CSF、 EPO、 IL-3購自Peprotech公司;胰酶、EDTA、全反式維甲酸、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤（IBMX）和二甲亞砜（DMSO）購自Sigma公司。
MSC的分離和培養
骨髓來自8例健康志愿者（年齡18-34歲，平均29歲）。髂后上棘抽取骨髓，用淋巴細胞分離液（密度1.077）400×g 離心20分鐘，取白環以上細胞部分，計數后接種于含40% MCDB、2% FCS的DF12培養液中，置37℃、5% CO2培養箱中培養，24小時后換液，去除未貼壁細胞。當細胞達到70%融合時，常規消化傳代。
MSC的凍存和復蘇
將1×106細胞加入含10％ DMSO和40% FCS的IMDM中，總體積1.8 ml。先置于-80℃冰箱中，第二天轉入-196℃中凍存。將中期9-15個月（平均13個月）和短期（4周）凍存的MSC置于37℃水浴中快速復溫，凍融后加入8 ml IMDM混勻后離心，然后再用IMDM洗滌1次，置于37℃、5％ CO2培養箱中培養。第2天，更換新鮮培養液。
細胞活性和增殖能力測定
應用臺盼藍拒染回收率（TBR）試驗檢測復蘇細胞的活性，TBR(%)＝凍存后活細胞計數/凍存前活細胞計數×臺盼藍拒染率×100％。將凍存前后的MSC接種在24孔板中（5×103細胞/孔），置37℃、5% CO2培養箱中培養，每隔1天取2孔細胞進行計數，計算均值，繪制生長曲線。
細胞免疫表型分析
用含20 g/L BSA的PBS將胰酶消化后的MSC制成1×106 cells/ml的細胞懸液。每個上機試管中加入500 μl細胞懸液，先加入鼠抗人CD11b、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD105和HLA-DR單克隆抗體，同時設空白對照，于4℃孵育30分鐘，PBS洗3遍。再加入FITC標記的羊抗鼠IgG，4℃孵育30分鐘，PBS洗4遍，用流式細胞儀檢測。使用cellquest軟件獲取并分析數據。
體外誘導多向分化檢測
成骨誘導 將5×104細胞接種于6孔板中，加入含10-7mol/L地塞米松、10 mol/L β磷酸甘油、0.05 mol/L維生素C和10% FCS的IMDM，3周后應用von Kossa染色檢測鈣化小結。
脂肪誘導 將5×104細胞接種于6孔板中，加入含10-6 mol/L地塞米松、0.5 mol/L IBMX 、0.1 mol/L維生素C和10% FCS的IMDM，7天后油紅O染色檢測脂肪滴。
支持造血的能力測定
將凍存前后的骨髓MSC用10.0 Gy 60Co γ線照射，然后更換為長期培養液（含12.5％ FCS、 12.5%馬血清、2 mmol/L谷氨酰胺、10-6 mol/L 氫化考的松的IMDM）。獲取健康人骨髓單個核細胞，預先培養4小時以去除貼壁細胞，將懸浮細胞按照1×106/ml接種在照射后的MSC中，在37℃、5% CO2條件下培養，每周半量換液。4周后獲取全部細胞接種于甲基纖維素體系中測定其集落形成能力。培養體系為: IMDM中含30%馬血清、1% BSA，2 mmol/L谷氨酰胺、1×10-4/L β2巰基乙醇、1%甲基纖維素和重組細胞因子。細胞因子包括: rhSCF 50 ng/ml，IL-3 10 ng/ml，GM-CSF 50 ng/ml 和EPO 4 U/ml。集落形成實驗在24孔培養板中進行，于37℃、5% CO2條件下培養14天。每孔接種1×106個細胞。14天后在倒置顯微鏡下計數集落，50個以上細胞為1個集落。
統計學分析
采用SPSS 11.0軟件進行統計分析，實驗數據用平均值±標準誤表示，組間比較應用方差分析。
結 果
骨髓MSC的形態特征和生長特點
于倒置顯微鏡下，凍存前骨髓MSC為成纖維樣，胞漿豐富，核染色質細，核仁明顯，平行排列或旋渦樣生長。根據細胞生長曲線，骨髓MSC的倍增時間約為42.03士2.41小時。細胞形態和倍增時間隨著細胞傳代并不發生改變。
凍存后MSC的活性率和增殖能力
骨髓MSC的活性率（TBR）隨著凍存時間的延長略有下降。短期凍存MSC的TBR為93士2.51％；中期凍存MSC的TBR為90士3.75％。二者之間并沒有顯著性差異。凍存后MSC的增殖能力同凍存前相比較，沒有明顯差異。依據生長曲線可以得出短期和中期凍存后骨髓MSC的倍增時間分別為39.54士3.53小時和41.64士1.68小時。
凍存前后MSC的免疫表型
通過流式細胞儀檢測凍存前后骨髓MSC的免疫表型發現，凍存前后MSC均表達CD29、CD44、CD105，而CD11b、CD31、CD34、CD45和HLA-DR均為陰性(表1)。CD分子的表達量在凍存前后略有不同，但均不存在顯著性差異。Table 1.Flow-cytometric phenotype analysis of adult bone marrow derived MSC before and after cryopreservation（略）
多系分化的鑒定
成骨分化 2周后細胞聚集成集落，并有少量鈣鹽沉積，繼續培養1周，細胞呈現多層生長的結節狀，并有大量鈣鹽沉積，而對照組細胞仍為單層生長，無鈣鹽沉積。von Kossa 染色證實為鈣鹽沉積(圖A)，對照組無上述現象出現。
成脂肪分化 3-5天后發現少量細胞中有小脂肪滴出現，繼續誘導，1周后可以看見大部分細胞胞體變大，胞漿出現大量脂肪滴，油紅O染色證實為脂肪滴(圖B)，而對照組細胞胞漿中無脂肪滴出現，油紅O染色為陰性。
凍存后的MSC同樣具有成骨和成脂肪分化能力(圖C，D)。
支持造血作用
為了評估凍存是否影響MSC支持造血的能力，將骨髓單個核細胞接種于照射過的凍存前和復蘇的MSC中，在長期骨髓培養液中培養4周后檢測CFU生成情況。如表2所示，凍存前后MSC均具有支持造血作用。CFU-GM，CFU-E和CFU-GEMM的產率在以凍存前、短期凍存和中期凍存后MSC為滋養層的骨髓長期培養體系中并無顯著性差異。Table 2.Hematopoiesis supported by MSC in long term bone marrow culture（略）
討 論
MSC是造血微環境中主要組成部分，通過合成、分泌多種造血因子和黏附分子來調控造血干細胞的增殖、分化和自我更新。既往研究顯示，MSC可以合成并分泌多種造血細胞生長因子，具有維持長期培養起始細胞(LTC-IC)的能力，促進造血干細胞的增殖和分化［5］。聯合MSC的移植方案還可以促進HSC的植入和移植后的造血恢復［6］。但是，在體外培養擴增中，MSC的增殖能力會逐漸下降并發生分化，支持造血的能力減弱。將擴增后或者增殖旺盛的MSC進行凍存，在需要的時候復蘇培養，可以有效地解放上述問題并確保提供足夠的MSC應用于臨床。
既往的大量研究顯示，造血干細胞可以在液氮中長期凍存，復蘇后仍然具有良好的造血重建能力。但是，MSC經過低溫凍存和復蘇，其增殖和分化能力、支持造血功能是否受影響，尚不明確。因此，我們觀察了骨髓MSC經過短期（4周）和中期（9-15月）凍存后的生物學特性和支持造血能力。結果顯示，經過中期和短期凍存后MSC的形態并未發生改變，仍為梭形，貼附在培養瓶底。凍存后MSC的活性略有下降，但凍存并不影響細胞的增殖能力，凍存前和中期、短期凍存后MSC的倍增時間在40小時左右，經統計學分析不具有顯著性差異。通過FACS檢測，凍存前后的MSC的免疫表型沒有明顯改變，表現為CD29、CD44和CD105為陽性，而CD11b、CD34、CD31、CD45、和HLA-DR為陰性。多向分化能力是MSC的主要特征之一，我們將經過中期和短期凍存后MSC誘導向脂肪和骨分化，結果顯示凍存后MSC仍然具有向脂肪和骨分化的能力，而且這種分化能力，并不隨著復蘇后細胞的傳代而發生變化。由此可見，中期和短期凍存并不影響MSC的生物學特性。
支持造血是骨髓MSC的重要功能之一，凍存后MSC支持造血能力是否發生變化將直接影響MSC的臨床應用。Majumdar等［7］的研究顯示，骨髓MSC可以分泌多種造血生長因子，具有支持造血作用，能促進骨髓來源的CFU-GM，CFU-E，CFU-Meg和CFU-GEMM的增殖。但是凍存后MSC支持造血能力如何變化，既往并無報道。在本實驗中，我們通過檢測體外長期培養體系中集落形成情況來評估凍存后MSC對造血干細胞的支持作用。骨髓單個核細胞在以凍存前、短期凍存和中期凍存后MSC作為滋養層的骨髓長期培養體系中培養，4周后的骨髓單個核細胞的CFU生成率在各體系之間沒有顯著性差別。這說明經過中期和短期凍存后MSC仍具有支持造血能力，同凍存前比較，支持造血能力沒有明顯變化。進一步分析上述不同培養體系中CFU-GM、CFU-E和CFU-GEMM的生成情況，結果表明：凍存前后MSC均可以促進CFU-GM、CFU-E和CFU-GEMM的增殖，而且MSC促進定向祖細胞的增殖能力在凍存前后沒有明顯差別。這些結果表明，凍存并不影響MSC促進不同階段造血祖細胞增殖、分化的能力。
綜上所述，本研究通過體外實驗初步證實：經過中期和短期低溫凍存的骨髓MSC并不改變其固有的生物學特性。雖然凍存可以導致部分細胞損傷，但是并不影響剩余細胞的增殖能力和多向分化能力。此外，凍存后的MSC仍然具有支持造血的功能。但是，凍存后MSC是否在體內仍具有上述生物學性狀和支持造血功能，尚需進一步研究證實。
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[關鍵詞]血管;組織工程;細胞外基質;生物力學
[中圖分類號]R318[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)07-0996-04
Effects of decellularization using biotic enzymes on the mechanical properties of the canine carotid artery
LIU Guo-feng1,HE Zhi-juan2,YANG Da-ping1,XU Xue-wu1,LIU Ying1,REN Li-hong1,LI Qing-chun1
(1.Department of Plastic Surgery,Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150086,Heilongjiang,China; 2.Department of Obstetrics and Gynecology,First Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 15001 0,Heilongjiang,China)
Abstract:ObjectiveThe objective of this study is to investigate the effects of decellularization using biotic enzymes on the mechanical and structural properties of the canine carotid artery.MethodsIntact canine carotid artery were decellularized by using Trypsin/EDTA,ribonuclease and desoxyribonuclease. Residual cellular and extracellular matrix composition was evaluated with hematoxylin and eosin (H&E) staining,quantitative DNA analysis and scanning electron microscopy. Tensile strength, burst strength and compliance were measured in vitro to determine the effects of decellularizedprocess on the biomechanical properties of the canine carotid artery.ResultsHistology and scanning electron microscopy examination demonstrate that scaffolds were completely decellularized and scaffolds revealed a well-preserved extracellular matrix. Compared with fresh canine carotid artery, decellularized artery had similar burst and breaking strength and had lower compliance.Conclusion This study demonstrates that the decellularized artery using biotic enzymes had similar burst and breaking strength and had lower compliance compared with fresh canine carotid artery.
Key words: vascular grafts; tissue engineering; extracellular matrix; biomechanical
血管組織工程學研究為臨床上小口徑血管移植物的制備提供了光明的前景,口徑小于6mm的小口徑組織工程血管研究與大口徑血管移植物的研究有很大的差別[1]。因為血管移植物與受區血管生物力學性質的匹配程度對不同口徑的組織工程血管移植物通暢率的影響差別較大,血管移植物的口徑越小受到的影響越大,小口徑血管移植物在受體內更容易發生內膜增生、中膜增厚,最后導致移植物的官腔狹窄甚至閉塞[2]。血管組織工程研究中支架材料的力學性質對血管移植物的生物力學性質起著決定性的作用,所以在小口徑組織工程工程血管的研究中制備與受區血管生物力學性質完全匹配的支架材料是最關鍵的科學問題,這將決定小口徑組織工程血管移植的遠期通暢率[3]。本實驗將對小口徑組織工程血管脫細胞基質生物支架材料的生物力學性質進行研究,明確生物酶聯合消化法對犬頸總動脈脫細胞基質材料生物力學的影響。
1材料和方法
1.1 實驗用動物:普通雜種家犬,體重25～30kg,6個月齡,雌雄不限。
1.2 實驗材料及主要儀器:胰蛋白酶(Trypsin)、核糖核酸酶(Ribonuclease,RNase)、脫氧核糖核酸酶(Desoxyribonu clease,DNase):美國Sigma公司;EDTA(Ethylenediamine tetraacetic acid)、磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate buffer solution,PBS):北京中杉生物公司;普通光學顯微鏡:日本Nikon公司;S-3400N型掃描電子顯微鏡:日本Hitachi公司;電子萬能實驗材料機:德國Zwick-Roell公司。
1.3 犬頸總動脈脫細胞基質材料制備: 無菌條件下切取犬頸總動脈,大量無菌PBS沖洗,去除血液成分及外層附屬軟組織,選擇切取長度約為7cm,內徑約為3mm的動脈,利用胰蛋白酶和核酸酶連續消化法去除動脈細胞及其碎片成分[4]。先用0.1% 胰蛋白酶加0.02% EDTA 溶液消化20h,中間更換1次消化液,大量PBS沖洗后用20μg/ml RNase +200μg/ml DNase溶液消化2h,大量無菌PBS 溶液沖洗。以上步驟均在5%CO2、37℃,80次/ min持續震蕩條件下進行。監測制備的脫細胞血管基質,使材料的細胞DNA殘留量少于0.1%。同時選取新鮮犬頸總動脈作為對照組(每組6例),進行以下檢測。
1.3 組織學染色 將標本置于10%中性甲醛溶液中固定24h,常規石蠟包埋、切片,進行HE染色。在普通光學顯微鏡下對標本的結構進行組織學評價照相。
1.4 掃描電鏡觀察 將標本在1%戊二醛溶液中固定24h以上,用1%餓酸作后固定2h,50%、70%、90%、100%丙酮梯度脫水,50%、70%、90%、100%醋酸異戊酷置換,應用臨界點干燥儀、液體C02等進行干燥;干燥的標本固定在鋁質標本臺上,用濺射鍍膜機鍍金后,用S-3400N型掃描電子顯微鏡系統觀察并照相。
1.5 生物力學檢測:利用Zwick/Roell Z010型電子萬能力學實驗機測定標本的拉伸強度、爆裂強度及軸向順應性。拉伸強度及軸向順應性檢測:將管狀標本(長度為5cm)兩端固定于微型夾具上,以0.5mm/s的速度拉伸,直至標本斷裂,系統自動記錄標本的應力-應變曲線及極限拉伸強度,計算出標本的軸向順應性。爆裂強度檢測:把管狀標本一端用絲線結扎,另一端固定于裝滿生理鹽水的5ml醫用注射器上,注射器筒壁固定于250ml玻璃葡萄糖瓶中,整個裝置平置在力學實驗機上,以40kPa/s的力向標本內注射生理鹽水,直至標本爆裂或漏液,系統自動記錄標本的爆裂強度。
1.6統計學分析: 所有定量實驗結果均用x±s表示,利用SPSS11.0統計學軟行獨立樣本t檢驗,P
2結果
2.1大體所見:犬頸總動脈脫細胞基質材料仍保持新鮮血管的管狀結構,血管的長度及內徑無明顯改變,材料外觀呈乳白色(圖1)。
2.2 組織學結構:新鮮犬頸總動脈具有血管典型的三層結構:內膜、中膜及外膜,中膜層較厚,包含大量的環狀排列藍染的細胞核成分和細胞外基質成分(圖2A)。經脫細胞處理后,血管壁中的藍染的細胞核成分全部去除,但脫細胞血管的細胞外基質中纖維成分保存完整連續,沒有發生斷裂破碎等。血管的中膜層結構中可見細胞及部分細胞外基質去除后遺留的空隙,同時血管內外膜結構的細胞外基質成分保持完好(圖2B)。
2.3 掃描電鏡觀察:脫細胞犬頸總動脈脫細胞基質橫斷面的掃描電鏡照片可見大致的三層細胞外基質結構,內層見完整致密的內彈性膜,中層可見成層環狀排列的纖維板層結構,纖維連續,可見梭形空隙,材料外層可見雜亂排列的外膜層纖維條索組織(圖3A)。材料內表面掃描電鏡照片顯示,材料的內彈性膜纖細的纖維呈網狀分布,纖維完整,未見明顯斷裂缺失,透過纖維網可見深部中膜層較粗大的纖維(圖3B)。
2.4 生物力學性質:爆裂強度檢測結果如下,脫細胞犬頸總動脈基質組為315.00±12.49 KPa,新鮮犬頸總動脈組為330.52±18.73 KPa,兩組標本爆裂強度相似,差別無統計學意義(P>0.05)(圖4)。極限拉伸強度檢測結果如下:脫細胞犬頸總動脈基質組為4 122.91±118.05 KPa,新鮮犬頸總動脈組為4 212.99±103.80 KPa,兩組標本極限拉伸強度相似,差別無統計學意義(P>0.05)。軸向順應性計算結果如下,脫細胞犬頸總動脈基質組為0.945±0.158 mm/mm,新鮮犬頸總動脈組為1.195±0.22 mm/mm,脫細胞犬頸總動脈基質組軸向順應性低于新鮮犬頸總動脈組,差別有統計學意義(P
3討論
具有三維空間結構的支架材料是構建組織工程血管的基本要素之一,能為血管種子細胞生長和組織發育提供臨時的支撐骨架,并能夠調控所構建血管的形態。研制和開發理想的支架材料仍然是血管組織工程所面臨的巨大挑戰。為了克服可降解高分子聚合物材料在生物相容性方面的不足,很多學者把研究目光轉移到了自然來源的生物支架材料上[5]。自然生物材料具有良好的生物相容性,能夠促進細胞的黏附、生長、增殖及生物功能的發揮。血管組織工程支架材料的發展趨勢是自然生物材料的應用,自然生物材料是最有應用潛力的組織工程支架材料來源[6]。血管脫細胞基質材料的三維空間結構與自然血管的結構非常類似,因此具有理想的外形和適當的生物力學性質,是血管組織工程學研究中較為理想的生物支架材料[7]。
正常血管的細胞外基質成分包含膠原纖維、彈性蛋白及蛋白聚糖等成分,膠原纖維及彈性蛋白對于血管的強度起關鍵性的作用。膠原纖維具有良好的抗張強度,對于維持血管的完整性具有重要意義,彈性蛋白和蛋白聚糖有一定的彈性,能夠使血管具有良好的順應性[8]。研究表明,脫細胞處理會改變血管原有的生物力學性質,特別是材料的順應性常會降低[9]。本實驗利用生物酶連續消化法制備的犬頸總動脈脫細胞基質材料在去除了細胞及DNA殘留物的同時,細胞外基質的纖維成分保持完整連續,所以脫細胞材料的拉伸強度和爆裂強度與新鮮血管相似。除膠原纖維和彈性蛋白等細胞外基質纖維成分外,蛋白聚糖成分在脫細胞處理過程中常會遭到破壞,蛋白聚糖的去除對于脫細胞血管的拉伸強度和爆裂強度沒有明顯的影響,但會使材料的彈性降低變硬,生物力學的表現是材料的順應性下降[10]。本實驗的結果也證實了這一點,經過生物酶連續消化脫細胞處理,脫細胞犬頸總動脈基質材料的軸向順應性有所降低,從組織學觀察可以看出,脫細胞后血管橫斷面膠原纖維和彈性蛋白等纖維條索中間出現很多梭形空隙,這些空隙是由于中膜內平滑肌細胞及蛋白聚糖的去除而形成的,因此,脫細胞犬頸總動脈的軸向順應性與新鮮血管相比有所降低。
組織工程血管的拉伸強度、爆裂強度的順應性是重要的生物力學力學評價指標,足夠的拉伸強度和爆裂強度能夠保證血管移植后能夠抵抗長期的血液動力學作用而不形成動脈瘤。而對于小口徑組織工程血管移植物,順應性與拉伸強度和爆裂強度相比顯得更為重要,小口徑血管移植物和受區血管之間的順應性要匹配,這是移植物長期成功的重要保證[11-12]。血管移植物與受區血管之間的順應性等力學性質錯配會導致血流動力學的變化,血流方向改變、剪切力增加、下游血流紊亂、循環張力改變,從而引起吻合口處的應力集中,刺激內膜增生的生長因子的釋放增加,促進了血栓的形成和新內膜的增生,最終導致血管移植物長期通暢率明顯降低[13-14]。脫細胞處理經常會導致血管細胞外基質材料順應性的降低,從而影響構建的小口徑組織工程血管與受區血管生物力學性質的匹配,導致移植失敗,所以提高以脫細胞血管基質為支架材料的小口徑組織工程血管的順應性是組織工程血管研究的瓶頸問題。可能的解決方案包括:(1)改進完善脫細胞血管基質材料的制備方法,在保證血管細胞成分完全去除的前提下盡量保留細胞外基質材料原有的生物力學性質;(2)通過在脫細胞血管基質材料上復合某種其他材料制備順應性良好的復合支架材料;(3)在體外利用脫細胞血管支架材料構建組織工程血管的過程中促使平滑肌細胞分泌大量新生細胞外基質成分,以增加組織工程血管的順應性。
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一、精選教材
教材是課程知識內容的載體，是進行教學活動的基本材料之一[2，3]。如何選擇和使用教材對教學任務的實施、完成和對教學質量的影響至關重要。通過對相關院校的走訪、大量資料的查閱以及結合本校水產養殖學科的專業特點、課程學時數以及授課對象，最終確定以翟中和等主編的《細胞生物學》為教學用教材，并及時跟進該書的新版本。在應用該教材的同時，特別注重其他教科書的參考和補充，如將王金發編著的《細胞生物學》、王堃仁等主編的《細胞生物學》、鄭國锠等主編的《細胞生物學》、Alberts主編的《Molecular Biology of the Cell》等作為本課程的參考教科書。此外，教師在備課過程中還注重尋求教科書之外的教學資源，如國內外重要學術期刊、國內外知名大學《細胞生物學》課程網站，特別是國外互聯網站上與細胞生物學知識相關的網絡資源。教學中將教材、參考教科書以及教科書之外的教學資源相互補充和凝練，力求教學內容的系統性和前瞻性。
二、教學內容的遴選
《生物化學》、《遺傳學》、《細胞生物學》和《生理學》等是水產學院重要的學科基礎課。這些課程在內容上聯系極為密切，相互交叉和滲透。在《細胞生物學》課程的教學中，既要避免本課程與其他課程內容的過度重復又要保證授課內容的完整性、體現細胞生物學的核心內容。根據水產學院的教學安排以及授課學生的實際情況，在《細胞生物學》理論課教學中對所用教材的內容進行遴選，合理取舍與合并，最終形成十章作為本校水產養殖學科《細胞生物學》理論課教學內容，即：“緒論”、“細胞的基本知識”、“細胞生物學的主要研究方法”、“細胞表面”、“細胞基質和內膜系統”、“線粒體”、“細胞骨架”、“細胞核與染色體”、“細胞周期和細胞的分裂與分化”和“細胞的衰老與凋亡”。《細胞生物學》理論課的教學內容遴選后，授課中以細胞的結構和功能為主線，從顯微、亞顯微和分子水平闡述細胞結構，特別是結構與功能的相關性，認識細胞重要生命活動的基本內容和本質，掌握細胞生物學的基本概念和基礎理論，在《生物化學》、《遺傳學》和《生理學》課程學習的基礎之上，通過《細胞生物學》的教學，使學生的知識體系更加系統化、深入化。
三、調整與優化教學內容，因材施教，提高教學效果
由于課堂教學仍然是在校學生獲取知識的主要形式[4]，因此教學內容確定后，教師要梳理每一章的教學內容，清晰講授的重點和應達到的具體教學目的。首先，教師要意識到第一次課的重要性，它對激發學生的學習興趣有著重要的作用。與其他課程一樣，課程的講授內容通常以緒論開篇。但是，不僅許多學生不重視緒論的內容，教師也容易出現缺乏對緒論講授的激情[5]。教學中我們將教材[1]中緒論的內容重排、調整與優化，收到了較好的教學效果。授課中將細胞生物學的發展簡史作為最先講授的內容，并結合一些與之相關的逸聞趣事，激發學生對該門課程學習的興趣，使學生在輕松的氛圍中了解學科的誕生、認識學科的發展與實驗儀器和技術進步的關系；通過介紹“細胞學說”的建立，不僅使學生掌握了該學說的基本原理，還使學生意識到善于點滴積累以及歸納和總結對學習和工作的重要性，通過上述學習學生們也弄清了細胞生物學最基本的研究內容。之后再介紹當今細胞生物學的主要研究內容和研究熱點，并將教材目錄與緒論的內容相聯系，這樣不僅使細胞生物學的研究內容深記于學生的腦海中，也便于他們對本課程后續內容的學習和提高學習的信心。其次，授課內容的順序編排要便于學生與已掌握的有關知識相銜接。根據授課對象的實際情況，教學中按著細胞的組織結構從外向內，即：細胞表面→細胞質→細胞核的順序，并將結構或功能上聯系極為密切的細胞結構的知識放在一起講授。以本課程的“細胞表面”與“細胞基質和內膜系統”兩章為例，對教材以及相關的教科書中的有關內容做了較大的調整，重新編排與優化。授課時“細胞表面”一章，首先介紹細胞表面的結構組成（質膜、細胞外基質和細胞外被、細胞表面的特化結構細胞連接），各結構的特點、功能以及這些結構的相互關系；通過這樣的講授使學生清楚地知道多細胞生物中雖然所有的細胞都具有“質膜”這樣一個界膜，它是細胞表面核心結構，但多細胞生物不僅由細胞構成，細胞外還有細胞外基質，同時沒有一個細胞是孤立的，細胞與細胞或與細胞外基質形成特定的組織連接結構，從而使多細胞生物成為一個和諧的統一體。之后再詳盡地介紹細胞表面核心結構——質膜的物質的運輸和信號轉導功能，通過這部分的學習又使學生對膜的不對稱性和流動性有了更好的理解。此外，由于核糖體與內質網在功能上的關系極為密切，因此將核糖體并入內膜系統中介紹，形成本課程的“細胞基質和內膜系統”一章。授課中首先講解非膜性細胞器——核糖體在細胞中的分布、化學組成和結構以及功能，之后介紹內膜系統中的內質網、高爾基體和溶酶體的超微結構與功能，但內質網和高爾基體的蛋白質加工功能與蛋白質的分揀形成本章獨立的一節，即“蛋白質的分揀與加工”，內容包含信號假說、蛋白質的修飾與加工、蛋白質的分揀和膜泡運輸，此節為本章的教學重點之一。介紹信號假說時，由于有了核糖體的知識基礎，再結合具體的研究成果，學生則很容易理解分泌性蛋白的合成在細胞基質中起始、肽鏈延伸暫停、向內質網膜轉移等信號假說的具體內容；通過本節其他知識內容的學習，清晰了蛋白質的修飾加工可發生在肽鏈的合成以及運輸過程中，因此構成了蛋白質合成、加工與運輸的完整體系。此外，將溶酶體的發生也獨立成節，放在“蛋白質的加工與分揀”一節之后，以溶酶體酶的M6P分揀途徑為例，將信號假說、蛋白質的加工與分揀以及膜泡運輸的部分內容串聯起來。通過上述講授內容的遴選、調整與優化，也使學生對結構、功能、發生上相互關聯的內膜系統的理解更加透徹。再次，根據教學時數適當安排自學與課后討論的教學內容，培養學生自主和探究學習的能力。如“細胞生物學的主要研究方法”一章，不可能在有限的學時內將該部分內容講透徹，因此該部分內容以學生自學、課下參觀相關的儀器設備及與教師交流討論的形式實現學生對該部分知識的獲取；此外根據授課專業特點，葉綠體的知識也以學生自學和課下與老師交流的方式進行。最后，注重講授內容與其他課程內容上既不過度重復又要較好地銜接。如在講授質膜的功能——鈉鉀泵的知識時注意與《生理學》膜電位的知識相聯系、細胞骨架中微絲的功能時注重與《生理學》以及《組織胚胎學》肌肉收縮內容的銜接，線粒體功能的講解則考慮與《生物化學》的內容不過度重復和較好的銜接，而細胞核與染色體的知識需要考慮學生在《遺傳學》課程上已掌握的知識。由于本課程的開設在上述幾門課程之后，這就要求我們與上述課程的任課教師以及授課學生良好的溝通，適當調整本課程的授課內容與重點，從而使學生通過《細胞生物學》課程的學習，使他們知識體系更加系統化、深入化。
由于細胞生物學的知識面廣、信息量大、發展快，因此教學內容的改革是教學改革最重要的部分。結合我校水產養殖學科的專業特點和授課對象的實際情況，對《細胞生物學》理論課的教學內容進行遴選、調整重排與優化，并且應用于《細胞生物學》的教學中，提高了教學效果。此外，通過多年的教學實踐我們深深地體會到，完成好教學內容，教師尤其要注重自身知識理論水平的提高，不斷地豐富教學內容，才能不斷提高教學效果與教學質量。
參考文獻：
[1]張晶，華子春.細胞生物學課程體系優化的實踐與思考[J].中國細胞生物學學報，2011，33（6）：716-719.
